آپتا حسگرهای عامل دار شده با نانو ذرات: استراتژی جدیدی برای تشخیص برخی ترکیبات مهم زیستی و تشخیص زودهنگام سرطان کبد
عنوان : آپتا حسگرهای عامل دار شده با نانو ذرات: استراتژی جدیدی برای تشخیص برخی ترکیبات مهم زیستی و تشخیص زودهنگام سرطان کبد
مقطع : دکتری شیمی
تعداد صفحات: 156
بخشی از متن:
یک آزمایش هموژن سریع بر اساس آپتامر جفت شده با نانو ذرات فلورسانس کننده نزدیک به ناحیه قرمز برای تشخیص مستقیم سلول های سرطانی در خون کامل بدون مراحل پیش جداسازی توسط دنت و همکارانش توسعه داده شد . یک زیست حسگر آپتامر - فلورسانس دیگر برای تشخیص سلول کامل توسط تیم تحقیقاتی جیکوس که یک DNA آپتامر با تمایل بالا برای سلول های بیماری زای کمپیلوباکتر ژژونی از طریق روش سلکس - سلول طراحی کردند. روش مشابهی توسط اک و همکارانش گزارش شده است . آنها یک آپتامر جفت شده با الکسا فلوئور (یک نوع رنگ فلورسانس کننده) را با ویژگی بالا برای عامل بیماری زای لیستریا توسعه دادند. این پیشرفت ها، یک راهبرد جدید برای تشخیص عامل بیماری زا در غذا و نمونه های محیطی است
تعدادی از آپتا حسگرهای فلورسانس بدون شناساگر هستند و می توانند حد تشخیص در سطح کسری از پیکو مولار فراهم کنند. برای مثال یک طرح بر اساس مکانیسم جابه جایی رشته القاء کننده هدف برای تشخیص کوکایین بنا نهاده شده است. در یک گزارش دیگر یک تعیین مقدار بدون شناساگر هموژن از طریق اندازهگیری کاهش فلورسانس کریستال بنفشه از طریق برهم کنش ویژه بین آپتامر آنتی ترومبین با ترومبین به دست آمد . همچنین یک آپتاحسگر بسیار حساس از طریق استفاده از انتقال انرژی رزونانس فلورسانس به عنوان یک روش تشخیص روی یک سطح گرافن تثبیت شده با آپتامر ویژه ترومبین توسط چنگ و همکارانش توسعه داده شد. در حالت استراحت، فلورسانس به وسیله آپتامر متصل به رنگ خاموش می شود، سپس به وسیله بازیابی فلورسانس بعد از معرفی ترومبین به سیستم و تشکیل کمپلکس دنبال می شود.
اگر چه تعداد نسبتا خوبی از نشریات پیشرفت ها در توسعه زیست حسگر برای ملکولهای کوچک را گزارش می کند ولی تعداد بسیار کمی از آن ها در واقع برای استفاده شان در کارهای زیستی به کار گرفته شده است. یک چنین کاربردی توسط از لپ و همکارانش ، که یک نانوحسگر بر اساس آپتامر برای اندازه گیری بر اساس فلورسانس ارتعاشات آدنوزین تری فسفات (ATP) استفاده کرده اند، تشریح شد. به علت این که تغییرات در سطوح ATP از طریق متابولیسم سلولی می تواند فعالیت های تنظیم کننده مختلف روی آنزیم ها و عموما مسیر های سلولی داشته باشد، فهم جزیی تری از سطوح درونی ATP در زمان واقعی به دست می دهد که بسیار مفید خواهد بود.
با استفاده از مخمر به عنوان یک سیستم مدل این گروه تحقیقاتی نه تنها تغییرات در سطح ATP را طی گلیکولیز نشان دادند بلکه دیگر ملکول ها که در این تغییرات درگیر بودند شامل ATP آز میتوکندری F0F1 ،ATP آز غشای پلاسما و ۲-داکسی گلوکز نیز مورد آزمایش قرار گرفتند. تشخیص همزمان و انتخابی ملکولهای کوچک چندگانه بر اساس تاتو ردیاب های طلای فلورسانس کننده چند رنگی از ویژگی بالای آپتامرها و خصوصیت خاموش کنندگی فلورسانس منحصر به فرد نانوذرات طلا بهره می گیرد
چکیده :
آپتامر ها ملکول های DNAیا RNA تک رشته ای هستند که از طریق یک فرآیند انتخاب و تقویت درون آزمایشگاهی جداسازی می-شوند. آپتامر ها با تمایل و ویژگی بالا با ثابت تفکیک قابل مقایسه با پادتن ها به گستره وسیعی از ملکول های هدف متصل می-شوند. در این کار پژوهشی آپتامر ها به عنوان یک نوع جدید از لایه های زیست تشخیص در زیست حسگر ها برای تشخیص ملکول های کوچک و سلول کامل به کار گرفته شدند. این تحقیق بر روی تشخیص الکتروشیمیایی سدیم دیکلوفناک و آدنوزین تری فسفات (ملکول-های کوچک) و سلول سرطان کبد (سلول کامل) به عنوان دو نمونه از هدف های آپتامر متمرکز گردید. تلاش به سمت استفاده از این آپتا حسگر ها در بافت های پچیده، و سرم خون انسان، به منظور نشان دادن کاربرد گسترده ی آپتامرها، به عنوان یک جایگزین برای پادتن نیزانجام شد. در بخش نخستین، یک آپتا حسگر الکتروشیمیایی بدون شناساگر برای تشخیص سدیم دیکلوفناک ارائه گردید. برای ساخت این آپتا-حسگر، آپتامر دیکلوفناک عامل دار شده با آمین، روی سطح یک الکترود کربن شیشه ای به طور کووالانسی متصل شد. هنگامی که الکترود اصلاح شده با آپتامر در معرض غلظت های مختلف دیکلوفناک قرارمی گیرد ساختار آپتامر روی سطح الکترود تغییر می کند. حضور دیکلوفناک یک تغییر در ساختار آپتامر تثبیت شده بر روی سطح القاء می کند و سبب کاهش مقاومت بار آپتا حسگر می شود. به هر حال مقاومت انتقال بار با خواباندن الکترود/آپتامر/دیکلوفناک با آپتامر ثانویه افزایش می یابد. تغییرات در مقاومت انتقال بار با استفاده از تکنیک های ولتامتری و اسپکتروسکوپی مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی دنبال شد. آپتا حسگر دو گستره دینامیک خطی مختلف بینmM 5-0 و mM 1- mM 10 نشان داد و حساسیت 7/15 کیلو اهم بر میکرو مولار و حد تشخیص 7-10 × 7/2 مولار برای آن به دست آمد. در بخش بعدی توانایی نانو ذرات نقره به عنوان برچسب اکسا-کاهشی در ساخت یک آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص آدنوزین تری فسفات مورد بررسی قرار گرفت. برای ساخت آپتا-حسگر، یک آپتامر شناخته شده برایATP به دو قسمت تقسیم شد. قسمت آمین دار شده اول آپتامر به طور کووالانسی روی سطح الکترود طلای اصلاح شده با 3- مرکاپتوپروپیونیک اسید از طریق تشکیل پیوند کربودی ایمید تثبیت شد. قسمت دوم آپتامر با نانوذرات نقره اصلاح شد و در حضور ATP با قسمت اول تجمع یافت. سیگنال اکسایش مستقیم نانو ذرات نقره به عنوان سیگنال تجزیه ای برای تشخیص ATP دنبال شد. سنجش ساندویچی به کار برده شده بازده سیگنال مناسب و مهم تر از آن زمان پاسخ خوبی نشان داد. با این حسگر می توان غلظت ATP را در مقیاس میکرو-مولار با پایداری بسیار مطلوب تحت شرایط بهینه اندازه گیری نمود. گذشته از آن نوکلوتید های مشابه شامل GTP، CTP، و UTP مزاحمت جدی نشان نداد و این حسگر هدفش را در محیط های پیچیده مانند پلاسمای خون انسان به راحتی تشخیص داد. با وجود کاربرد های نوید بخش آپتامر ها در آزمایشات زیستی، توسعه زیست حسگر های الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر با حد-تشخیص بهبود یافته هنوز به عنوان یک چالش اساسی مطرح است. در این راستا، یک راه برد برای تقویت سیگنال بر اساس کاربرد نانو ساختار ها به عنوان بستر هایی برای ساخت یک آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای ATP در بخش دیگر این پایان نامه معرفی شده است. یک آزمایش ساندویچی از طریق تثبیت یک قطعه از آپتامر ویژه ATP بر روی سطح الکترود طلای نانو متخلخل (NPGE) و تجمع آن با قطعه دوم آپتامر در حضور ملکول ATP طراحی شد. به دنبال آن ترکیب 3،4- دی آمینو بنزوییک اسید (DABA) به-عنوان یک گزارشکر ملکولی به عامل آمین قطعه دوم آپتامر متصل شد و سیگنال اکسایش مستقیم آن به عنوان سیگنال تجزیه ای دنبال گردید. نتایج نشان داد که حد تشخیص آپتا حسگر برای اندازه گیری ATP ده برابر بهبود یافته است و. با این آپتا-حسگر می توان غلظت های ATP را در مقیاس های کمتر از میکرو مولار تشخیص داد. بخش نهایی رساله حاضر به توسعه یک آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص سلول های سرطانی اختصاص داده شده است. تشخیص زود هنگام سرطان ها چالشی برای امکان درمان مؤثر است و آپتامر ها ردیاب های ملکولی بسیار نوید بخشی در این زمینه هستند. طی دو دهه اخیر آن ها به عنوان یک گروه جدید از ملکول های تشخیص برای تشخیص سلول های کامل از طریق فرآیند سل- سلکس انتخاب شده اند. با بهره گیری از آپتامر TLS11a که به طور ویژه به سطح غشاء سلول های سرطان کبد متصل می شود یک راهبرد سر راست برای تشخیص سرطان کبد در مراحل اولیه معرفی-شده است. جهت ساخت زیست حسگر، شرایط مختلف تثبیت آپتامر TLS11a آمین دار شده بر روی الکترود طلای اصلاح شده با MPA از طریق شیمیEDC/NHS و استفاده از آن در یک قالب ساندویچی، بهینه شد. استفاده از آپتامر TLS11a به عنوان لایه تشخیص، حسگری با تمایل بالا برای سلول های سرطانیHepG2 در مقایسه با سلول های سرطانی کنترل پروستات، سینه و روده انسان ارائه می کند. آپتاحسگر یک گستره دینامیک خطی وسیع از 102 × 1 تا 106 × 1 سلول بر میلی لیتر با حد تشخیص 2 سلول بر میلی لیترارائه داد. این پروتکل یک ابزار دقیق برای تشخیص حساس سرطان کبد با مزایای مهمی مانند سادگی، قیمت پایین و پایداری ارائه می دهد. کلید واژه ها: آپتامر، آپتا حسگر، سدیم دیکلوفناک، آدنوزین-تری فسفات، نانو ذره نقره، نانو متخلخل، 3،4- دی آمینو بنزوئیک اسید، سرطان
فهرست : فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول : مقدمه و تئوری
1-1- مقدمه 1
1-2 تئوری 3
1-2-1-آپتامر 3
1-2-2- آپتامر ها و فرآیند انتخاب از طریق SELEX 4
1-2-3- سلکس- سلول 8
1-2-4- کاربرد های زیست تجزیه ای آپتامرها 9
1-2-4-1- سنجش آپتامر متصل به ردیاب 10
1-2-4-2- خالص سازی تمایلی بر اساس آپتامر 13
1-2-4-2-1- کروماتوگرافی 13
1-2-4-2-2- الکتروفورز مویینه 13
1-2-4-2-3- میکروفلوئیدیک 14
1-2-4-3- زیست حسگرها- آپتا حسگرها 16
1-2-4-3-1- آپتا حسگرهای شیمی نورتابی 16
1-2-4-3-2- آپتا حسگرهای فلورسانس 17
1-2-4-3-3- آپتا حسگرهای بر اساس نقاط کوانتومی 19
1-2-4-3-4- آپتا حسگرهای رنگ سنجی 20
1-2-5-3-5 آپتا حسگرهای بر اساس تشخیص جرم 21
1-2-4-3-6- آپتا حسگرهای بر اساس ترانزیستور اثر میدان 25
1-2-4-3-7- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی 27
1-2-4-3-7-1- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی بر اساس تک لایه آپتامر فعال اکساکاهشی متصل به الکترود 27
عنوان صفحه
1-2-4-3-7-2- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی تقویت شده بر اساس آنزیم 32
1-2-4-3-7-3- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی تقویت شده بر اساس نانوذرات 36
1-2-4-3-7-4- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی بدون شناساگر بر اساس اسپکتروسکوپی مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 37
1-2-4-3-7-5- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی برای ملکول های کوچک 40
1-2-4-3-7-5-1- آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای دیکلوفناک 42
1-2-4-3-7-5-2- آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای آدنوزین تری فسفات (ATP) 45
1-2-5- سرطان 50
1-2-5-1- آپتا حسگرهای الکتروشیمیایی برای سلول های کامل 51
1-2-5-1-1- سرطان کبد و تشخیص زود هنگام آن 56
1-2-6 اهداف پروژه 58
فصل دوم: بخش تجربی
2-1- مواد و معرف های مورد استفاده 60
2-2- آپتامر های مورد استفاده 62
2-3- دستگاه های مورد استفاده 64
2-3-1- دستگاه های الکتروشیمیایی 64
2-3-2- سایر دستگاه های مورد استفاده 64
2-3-3- دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) 64
2-3-4- دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) 65
2-3-5- طیف سنجی فرابنفش- مرئی (UV-Vis.) 65
2-4- آماده سازی محلول ها 65
2-5- حسگر الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر برای تشخیص دیکلوفناک 67
عنوان صفحه
2-5-1- ساخت حسگر 67
2-5-2- تهیه نانوذرات نقره 68
2-5-3- آماده سازی محلول نانوذره نقره /DBA برای بررسی های نوار پلاسمون سطحی 68
2-5-4- اندازه گیری های الکتروشیمیایی 69
2-5-4-1- اندازه گیری های ولتامتری چرخه ای 69
2-5-4-2- اندازه گیری های مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 69
2-5-4-3- اندازه گیری های نوار پلاسمون سطحی 69
2-6- آپتا حسگر الکتروشیمیایی بر پایه نانوذرات برای تشخیص آدنوزین تری فسفات (ATP) 70
2-6-1- ساخت حسگر ATP 70
2-6-2- اندازه گیری های الکتروشیمیایی 71
2-6-2-1- اندازه گیری های ولتامتری پالس تفاضلی 71
2-6-2-2- اندازه گیری های مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 71
2-7- توسعه آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص آدنوزین تری فسفات (ATP) با استفاده از یک بستر نانومتخلخل 72
2-7-1- آماده سازی الکترود طلای نانومتخلخل (NPGE) 72
2-7-2- سل الکتروشیمیایی 73
2-7-3- اصلاح سطح الکترود طلای نانومتخلخل 74
2-7-4- اندازه گیری های الکتروشیمیایی 74
2-8- توسعه آپتا حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص زود هنگام سلول های کامل (کبد) 75
2-8-1- تثبیت آپتامر روی سطح الکترود طلا 75
2-8-2- اصلاح کریستال QCM 75
2-8-3- کشت و تثبیت سلولی 75
2-8-4- آزمایش MTT 76
عنوان صفحه
2-8-5- اندازه گیری های الکتروشیمیایی 76
2-8-6- اندازه گیری های کوارتز کریستال میکروبالانس 77
فصل سوم :نتایج و بحث78
3-1- طراحی و ساخت یک آپتا حسگر بدون شناساگر برای تشخیص الکتروشیمیایی سدیم دیکلوفناک 79
3-1-1- اکسیداسیون سطح الکترود کربن شیشه ای، انتخاب پتانسیل و زمان بهینه اکسایش الکتروشیمیایی 79
3-1-2- بهینه سازی زمان فعال سازی گروه های اسیدی سطح الکترود کربن شیشه ای 80
3-1-3- بهینه سازی زمان تثبیت 6- آمینوهگزانوییک اسید (AHA) روی سطح الکترود کربن شیشه ای حاوی گروه های اسیدی فعال سازی شده 81
3-1-4- بهینه سازی غلظت آپتامر تثبیت شونده روی سطح الکترود 82
3-1-5- بهینه سازی زمان تثبیت آپتامر ویژه دیکلوفناک (DBA) 83
3-2-5- بهینه سازی زمان برهمکنش آپتامر DBA و دیکلوفناک 84
3-1-6- سنتز وبررسی نانوذرات نقره برای مطالعات پلاسمونیک 85
3-1-7- بررسی ابعاد نانوذرات نقره با روش میکروسکوپ الکترون عبوری TEM 85
3-1-8- توصیف خصوصیات الکتروشیمیایی حسگر اصلاح شده 87
3-1-9- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر DBA 89
3-1-10- تعیین خصوصیات تجزیه ای حسگر (GCE/AHA/DBA) برای تعیین مقدار کمی دیکلوفناک 90
3-1-11- تکرارپذیری، انتخاب پذیری، و پایداری آپتا حسگر 95
3-1-12- مطالعات پلاسمون سطحی 96
3-2- نانوذرات نقره جفت شده با آپتامر برای تشخیص الکتروشیمیایی آدنوزین تری فسفات 100
3-2-1- سنتز و شناسایی نانوذرات نقره 100
3-2-2- بررسی رفتار الکتروشیمیایی نانوذرات نقره بر روی سطح الکترود طلا در pHهای مختلف 100
3-2-2-تعیین سطح الکترود طلا 101
3-2-3- ساخت آپتا حسگر اصلاح شده با نانوذرات نقره 102
عنوان صفحه
3-2-4- تعیین صفات اختصاصی الکتروشیمیایی سطح حسگر 103
3-2-5- بهینه سازی مراحل ساخت زیست حسگر 104
3-2-6- رفتار الکتروشیمیایی آپتا حسگر ATP در حضور و غیاب ملکول هدف. 106
3-2-7- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر 107
3-2-8- بررسی های ولتامتری 108
3-2-9- گزینش پذیری، پایداری و تکرار پذیری آپتا حسگر ATP 108
3-3- توسعه یک زیست حسگر الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر تقویت شده برای تشخیص آدنوزین تری فسفات با استفاده از یک بستر طلای نانومتخلخل 112
3-3-1- رفتار الکتروشیمیایی DABA در سطح الکترود طلا برهنه 112
3-3-2- آماده سازی الکترود طلای نانومتخلخل 113
3-3-3- اصلاح سطح حسگر و تعیین صفات اختصاصی آن 115
3-3-4- بهینه سازی مراحل ساخت زیست حسگر 118
3-3-5- بررسی رفتار الکتروشیمیایی آپتا حسگرATP بر پایه الکترود نانومتخلخل در حضور گزارش گر ملکولی DABA. 120
3-3-6- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر 121
3-3-7- کارایی تجزیه ای آپتا حسگر 122
3-3-8- گزینش پذیری، پایداری و تکرارپذیری آپتا حسگر 122
3-4- تشخیص بر اساس آپتامر بدون شناساگر سلول های سرطان کبد 126
3-4-1- آپتا سنسینگ سلول کامل 127
3-4-2- تعیین مقدار چگالی سطحی آپتامر 133
3-4-3- کارایی تجزیه ای آپتا حسگر 133
3-4-4- زیست سازش پذیری سلول 139
نتیجه گیری و دورنمای آینده 140
برای کسب اطلاعات بیشتر با ایمیل payaname@outlook.com در ارتباط باشید
