مطالعه اثر پاکلوبوترازول بر شاخص های مولکولی و فیزیولوژیک گیاه Stevia rebaudiana B تحت تنش خشکی در کشت شیشه
مقطع : دکتری زیست شناسی
تعداد صفحات: 198
بخشی از متن:
گیاه Stevia rebaudiaua Bertoni به مدت بیش از یک قرن به عنوان یک شیرین کننده طبیعی در پاراگوئه استفاده می شود و محصولات آن به طور فزاینده ای برای حدود یک ربع قرن در بسیاری از غذاها و نوشیدنی های ژاپنی در دسترس است. همچنین در عرض چند سال گذشته به عنوان مکمل های غذایی در ایالات متحده و کشورهای اروپایی به طور گسترده ای استفاده می شود. در نقاط مختلفی از جهان، هیچ مدرکی دال بر اثرات جانبی سوء بر سلامت انسان به دلیل مصرف عصاره این گیاه ارائه نشده است (2003 ,.Geuns et al).
گیاه دارویی Stevia rebadiaa Bertoni دارای شیرین کننده طبیعی استویول گلیکوزیدها می باشد و بومی منطقه نیمه مرطوب است. خشکی یکی از مهمترین تنش های محیطی است که تولید محصول را در قسمت های مختلف جهان کاهش می دهد. ماده تنظیم کننده رشد پا کلوبوترازول به عنوان مقاوم کننده گیاهان در برابر تنش های محیطی شناخته شده است. استویول گلیکوزیدها و جیبرلین دارای مسیر بیوسنتزی مشترک می باشند. تیمار پاکلوبوترازول با دخالت در مسیر بیوسنتز اسید جیبرلیک از تولید این هورمون گیاهی ممانعت می کند و احتمالا می تواند بر بیوسنتز استویول گلیکوزیدها نیز تاثیر داشته باشد. با بررسی پاسخ های گیاه استویا به تنش خشکی در حضور پاکلوبوترازول امکان شناسایی صفات مطلوب و زمینه انتقال ژنهای مفید به گیاه جهت افزایش مقاومت به تنش خشکی فراهم می شود.
گیاه Stevia rebaudiana Bertoni
گیاه استویا متعلق به خانواده آستراسه و طایفه Epartoriae می باشد. این طایفه دارای پنج جنس Mickania Koanophyllon Chromolaena Ageratin و Stevia می باشد. جنس استویا متشکل از ۳۰۰ - ۱۵۰ گونه از گیاهان بوته ای و درختچه ای می باشد که در ارتفاعات ۵۰۰-۳۰۰۰ متری مناطق کوهستانی نیمه خشک، مراتع و دامنه کوهها می رویند (2002 ,Kinghorn).
نام جنس استویا اولین با توسط یک گیاهشناس اسپانیایی به نام Cavanilles در سال ۱۷۹۷ به کار گرفته شد (به نقل از 2002 ,Kinghorn). گیاه Stevia rebaidiana برای اولین بار در سال ۱۸۸۷ توسط یک گیاه شناس سوئیسی به نام Moises Santiago Bertoni در کاوش های گیاه شناسی در جنگل های شرقی پاراگوئه کشف شد. Bertoni به افتخار یک شیمیدان اهل پاراگوئه به نام Rebaudi این گیاه را Stevia rebaidiana نامید. Bertoni از سال ۱۹۰۳ مطالعات خود را بر روی استویا آغاز نمود و نتایج آن را منتشر نمود. پس از انتشار نتایج تحقیقات توسط Bertoni سایر محققان به مطالعه بر روی این گیاه پرداختند.
Kinghorn (۲۰۰۲) تعدادی از گیاه شناسان فعال در زمینه استویا را معرفی نموده است که عبارتند از: Bonpla و همکاران (۱۸۲۰)، Grisebach ، (۱۸۳۶ ) De Candolle ، ( ۱۸۲۵ ) Schultz - Bipontinus
در طول قرن بیستم، Stevia rebaudiaua Bertoni و ترکیبات شیرین کننده آن ثبت اختراع شدند. استویوزید (فراوان ترین جزء شیرین کننده برگ) و ent - kaurene diterpene diglycoside برای اولین بار در دهه اول قرن بیستم به طور ناخالص جداسازی شدند (1905 ,Bertoni) اما ساختار شیمیایی آنها نزدیک به شصت سال بعد شناسایی شد (1963 ,.Mosettig et al). در دهه ۱۹۷۰ گروه تحقیقاتی پروفسور Osamu Tanaka در دانشگاه هیروشیما در ژاپن دومین شیرین کننده اصلی تحت عنوان ریبودبوزید" A را استخراج نمودند (به نقل از 1976 ,.Kohda et al). پس از آن، شش گلیکوزید شیرین با غلظت های کمتر با عناوین استویول بیوزید، ریبودبوزید B - E و دولوکوزید
A را استخراج کردند
مشخصات گیاه شناسی
گیاه Stevia rebaidiaa Bertoni بومی مناطق باتلاقی با خاک اسیدی واقع در دره Rio Monday در شمال شرق پاراگوئه می باشد. سایر خاستگاه های این گیاه کشورهای برزیل، کانادا، آمریکا، مکزیک، کره و غیره می باشند (1992 ,Brandle and Rosa). از سایر اسامی محلی این گیاه می توان برگ عسلی ، برگی شیرین و برگ شکریه را نام برد.
Stevia rebandiana Bertoni یک گیاه چند ساله با ریشه های نخ مانند، ساقه ای باریک، بلند و افراشته به طول ۳۰-۵۰ سانتی متر است که سالیانه شاخه های ثانویه تولید می کنند (شکل های ۱-۱ و ۱-۲). در زیستگاه های وحشی استویا به شکل گیاهی باریک و کم شاخه با ساقه و برگ های سبز و پوشیده شده با موهای بسیار ظریف، کوتاه و سفید است. با کشت ساقه معمولا شاخه های جانبی متعددی تولید می گردد که نتیجه آن تشکیل یک تاج کم و بیش مدور و متراکم است. برگهای له شده گیاه دارای عطر خاصی هستند و تمام قسمت های سبز گیاه دارای طعم و مزه شیرین است.
Stevia rebaudiaua، دارای برگها ساده با آرایش متقابل و به ندرت متناوب، در شکل و اندازه های بسیار متغیر، بیضوی باریک تا مستطیلی، به طول ۲-۳ سانتی متر، عرض ۰/ ۶-۱ سانتی متر، با حاشیه دندانه دار است. برگ های خشک گیاه به رنگ سبز زیتونی یا سبز مایل به قهوه ای و معمولا تیره تر در سمت رویی برگ با دمبرگی به طول ۳-۴ میلی متر و میان گره هایی به طول ۲-۴ سانتی متر است.
Stevia rebadiaa دارای گل آذین خوشه دیهیم، دمگل های بسیار بلند و باریک به طول ۱-۴ سانتی متر، در هر طبق دمگل های کوچک و باریک به طول ۱-۴ میلی متر، برگک های خطی نوک تیز با طول ۱-۲ میلی متر احاطه شده توسط گریبانه ای که در نیمه پایینی سبز روشن و در نیمه بالایی مایل به زرد است. هر طبق از ۵ گلچه سفید تشکیل شده است. هر گلچه دارای جام گل لوله ای بلند و باریک با طولی برابر یا بلندتر از کاسه گل (حدود ۴ میلی متر)، پوشیده شده با موهای بسیار ریز از سمت داخل، تقریبا بدون کرک در سمت خارج است. این گیاه دارای بذرهای دوکی شکل با ۵ سطح مقعر زاویه دار و پوشیده شده از موهای ریز در قسمت راسی می باشد.
انواع گلیکوزیدهای Stevia rebaudiana
Stevia rebadiana، تنها گونه گیاهی شناخته شده علاوه بر Stevia phlebophyl است که استویول گلیکوزید تولید می کند. برگ های Stevia rebaitdiala انواع متعددی از استویول گلیکوزید را با غلظت های متفاوت بسته به ژنوتیپ و محیط زیست تولید می کنند . با توجه به جدیدترین مطالعات تا کنون ۳۳ نوع استویول گلیکوزید شناخته شده است. استویول فاقد قند دارای دو گروه هیدروکسیل است، که یک گروه به کربن شماره ۱۹ کربوکسیلیک اسید و دیگری به کربن شماره ۱۳ متصل می شوند که هر دو گروه می توانند گلیکوزیله شوند (جدول ۱-۱).
استویوزید فراوانترین استویول گلیکوزید است که می تواند ۱۰٪ از وزن خشک برگ را تشکیل دهد و حدود ۳۰۰ بار شیرین تر از ساکارز است. این یک ماده ۱۰۰% طبیعی و بدون کالری است که برای اولین بار به صورت ناخالص در دهه اول قرن بیستم جدا شد (1918 ,1905 ,Bertoni). در دهه ۱۹۷۰ استویوزید خالص به شکل تجاری و به عنوان شیرین کننده و طعم غذاها و نوشیدنی ها در ژاپن و جایگزینی برای شیرین کننده های مصنوعی ممنوع شده در بازار به کار گرفته شد. تاکنون ژاپن بزرگترین و متنوع ترین مصرف کننده استویوزید در
جهان است. از مزایای استفاده از استویوزید به عنوان یک مکمل غذایی برای افراد بشر می توان به بدون کالری بودن، حفظ سلامت دندان، مناسب بودن برای افراد مبتلا به دیابت و فنیل کتونوری" (PKU) و چاقی اشاره نمود (Geuins et al., 2003).
ریبود یوزید A از لحاظ فراوانی دومین استویول گلیکوزید بعد از استویوزید است و حدود ۲-۴٪ از وزن خشک برگ را تشکیل می دهد. دولت فرانسه برای اولین بار در سپتامبر سال ۲۰۰۹ استفاده از ۹۷% ریبودبوزید A را در مواد غذایی و نوشیدنی ها در اتحادیه اروپا به تصویب رساند. برخلاف استویوزید، مصرف ریبود یوزید A به عنوان مکمل های غذایی تاثیری در کنترل فشار خون و قند خون ندارد و این نشان دهنده ناکارآمدی مصرف آن در بیماری دیابتی است
تنش خشکی
رشد و نمو گیاهان تحت تاثیر خصوصیات ژنتیکی و شرایط محیط می باشد. عواملی نظیر دما، رطوبت، تشعشع، مواد غذایی و غیره می توانند رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار داده و باعث کاهش و یا افزایش عملکرد آنان شوند. یکی از مهمترین تنش های محیطی تنش خشکی است و از بین عوامل محیطی تنش زا خشکی دومین عامل اصلی کاهش عملکرد بعد از عوامل بیماری زا می باشد. خشکی مهمترین عامل محدود کننده تولید موفقیت آمیز محصولات گیاهی در سراسر جهان به حساب می آید و این عامل هنگامی ایجاد می شود که ترکیبی از عوامل فیزیکی و محیطی باعث تنش در گیاه شده و در نتیجه تولید را کاهش می دهند. این کاهش در نتیجه تاخیر یا عدم استقرار گیاه ، تضعیف یا از بین رفتن گیاهان استقرار یافته و تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در سوخت و ساز گیاهان به وجود می آید
راه کارهای مقاومت به خشکی
پاسخ گیاهان به تنش خشکی متفاوت است و گاهی گیاهان با خشکی سازگاری و تطابق می یابند. سازگاری به تغیرات مورفولوژیکی یا متابولیسمی اطلاق می گردد که بقای گیاه را در محیط افزایش می دهد. عملکرد گیاهان در شرایط کمبود آب بستگی به کل آب قابل دسترس و راندمان مصرف آب گیاه دارد. گیاهی که توانایی کسب آب بیشتر یا راندمان مصرف آب بیشتری دارد به تنش خشکی مقاومتر خواهد بود. خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک زیادی در مقاومت به خشکی مؤثر هستند. بستن روزنه ها، کاهش سطح برگ، افزایش کارآئی فتوسنتز، کاهش تعرق کوتیکولی، ایجاد کرک روی سطح برگ، توسعه سیستم ریشه و تنظیم پتانسیل اسمزی از این جمله می باشند. تحمل به خشکی یک واژه عمومی است که در بر گیرنده دامنه ای از مکانیزم های مختلف است و به وسیله آنها، گیاهان می توانند شرایط خشکی را تحمل کنند.
چکیده :
چکیده: گیاه دارویی Stevia rebaudiana Bertoni دارای شیرین کننده طبیعی استویول گلیکوزیدها میباشد و بومی منطقه نیمه مرطوب واقع در مرز پاراگوئه و برزیل است. خشکی یکی از مهمترین تنشهای محیطی است که تولید محصول را در قسمتهای مختلف جهان به خصوص ایران که به عنوان کشور خشک و نیمهخشک شناسایی شده است، کاهش میدهد. ماده تنظیم کننده رشد پاکلوبوترازول بازدارنده سنتز هورمون جیبرلین میباشد و به عنوان مقاوم کننده گیاهان در برابر تنشهای محیطی نیز شناخته شده است. استویول گلیکوزیدها و جیبرلین دارای مسیر بیوسنتزی مشترک میباشند و تیمار پاکلوبوترازول با دخالت در مسیر بیوسنتز اسید جیبرلیک از تولید این هورمون گیاهی ممانعت میکند و احتمالا میتواند بر استویول گلیکوزیدها نیز تاثیر داشته باشد. با بررسی پاسخهای گیاه استویا به تنش خشکی در حضور پاکلوبوترازول امکان شناسایی صفات مطلوب و زمینه انتقال ژنهای مفید به گیاه جهت افزایش مقاومت به تنش خشکی فراهم میشود. در این مطالعه گیاهان Stevia rebaudiana در محیطهای کشت MS حاوی غلظتهای 0، 2%، 4% و 6% (وزن حجمی) پلیاتیلن گلیکول (با وزن مولکولی 6000) و 0، 1، 2 و 4 میلیگرم بر لیتر پاکلوبوترازول به مدت 2 هفته کشت داده شدند و خصوصیات فیزیولوژیک و مولکولی مختلف در شرایط کشت در شیشه مورد مطالعه قرار گرفتند. گیاهان قادر به رشد در غلظتهای بالای پلیاتیلن نبودند و میزان رشد آنها شدیداً کاهش پیدا کرد. نتایج نشان داد که پاکلوبوترازول سبب کاهش اثرات زیانبار خشکی بر رشد گیاه شد و گیاهان تیمار شده با پاکلوبوترازول در غلظتهای بالای پلیاتیلن گلیکول زنده مانده و قادر به رشد بودند. تنش خشکی بر میزان رشد، رنگیزههای فتوسنتزی، کربوهیدراتها، آنتوسیانینها و پرولین اثر منفی داشت و بیشترین کاهش در غلظت 6% پلیاتیلن گلیکول ملاحظه گردید. تیمار پاکلوبوترازول سبب پیشگیری از افت معنیدار آنتوسیانینها و کربوهیدراتها شد و تجمع پرولین را افزایش داد که میتواند در تطابق اسمزی و همچنین حفظ ساختارهای سلولی و آنزیمی نقش داشته و تحمل به تنش خشکی را افزایش دهد. تیمار پاکلوبوترازول به طور معنیداری از تجمع H2O2 و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء در تیمار پلیاتیلن گلیکول در مقایسه با تیمار مشابه بدون پاکلوبوترازول پیشگیری نمود درحالیکه باعث افزایش معنی دار میزان پروتئینها در گیاهان تحت تنش شد. نتایج الکتروفورز SDS-PAGE نشان داد که میزان بیان یک پروتئین 25 کیلودالتونی در گیاهان تحت تنش توام با پاکلوبوترازول افزایش یافت که این پروتئین نقش مهمی در پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی ایفا مینماید. تنش خشکی در گیاه استویا سبب تحریک آنزیمهای آنتیاکسیدانت کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز و کاهش فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز شد درحالیکه بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز اثر معنیداری نداشت. موثرترین آنزیم در جاروب کردن H2O2 در گیاهان استویا آنزیم کاتالاز بود. تیمار پاکلوبوترازول در گیاهان تحت تنش خشکی میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانت کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز را افزایش داد و به این ترتیب حفاظت آنتی اکسیدانی گیاه استویا را در برابر تنش خشکی افزایش داد. تنش خشکی و تیمار پاکلوبوترازول میزان مخزن آسکوربات را افزایش دادند درحالیکه تغییر معنیداری در گلوتاتیون کل ملاحظه نگردید. میزان فعالیت آنزیمهای P5CS و PDH درگیر در متابولیسم پرولین در تیمارهای پلیاتیلن گلیکول تغییری نشان ندادند درحالیکه میزان بیان ژن P5CS در راستای تغییرات محتوی پرولین برگ تغییر نمود. تنش خشکی و تیمار پاکلوبوترازول باعث کاهش استویول گلیکوزیدها از قبیل استویوزید، ریبودیوزید A, B, C, F، دولوکوزید A، استویول بیوزید، روبودیوزید و استویول گلیکوزید کل شدند که این کاهش احتمالا به دلیل کاهش تولید یا افزایش تخریب آنها میباشد. در تنش خشکی و تیمار پاکلوبوترازول بیان ژنهای ent-KS، ent-KAH و UGT74G1 تغییر معنیداری نشان نداد درحالیکه کاهش معنیداری در بیان ent-KO، UGT85C2 و UGT76G1 ملاحظه شد. ent-KO یک ژن کلیدی در مسیر بیوسنتز استویول گلیکوزیدها میباشد که احتمالا کاهش بیان آن در تیمارهای پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول بر تولید استویول گلیکوزیدها اثر منفی داشت و میزان پیشماده برای سنتز قندهای اختصاصی استویا را کاهش داد. نتایج این تحقیق نشان داد که گیاه Stevia rebaudiana یک گیاه حساس به تنش خشکی است که در غلظت 6% پلیاتیلن گلیکول قادر به رشد و بقا نمیباشد و تیمار پاکلوبوترازول سبب کاهش اثرات مضر تنش خشکی شد و غلظت 2 میلیگرم بر لیتر پاکلوبوترازول موثرترین غلظت در گیاه استویا بود. کلمات کلیدی: آنتیاکسیدانها، اسمولیتها، استویول گلیکوزیدها، پاکلوبوترازول، تنش خشکی، HPLC ،Real-Time PCR، Stevia rebaudiana
فهرست : فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: کلیات و اهداف
1-1مقدمه 1
1-2 گیاه Stevia rebaudiana Bertoni 2
1-3 مشخصات گیاهشناسی 3
1-4 انواع گلیکوزیدهای Stevia rebaudiana 6
1-5 مسیر بیوسنتز استویول و جیبرلین 8
1-6 خواص آنتی اکسیدانی استویول گلیکوزیدها 16
1-7 تنش خشکی 16
1-8 راهکارهای مقاومت به خشکی 16
1-8-1 کاهش میزان رشد 17
1-8-2 تنظیم اسمزی 17
1-8-2-1 عملکرد پرولین در گیاه 18
1-9 تنش اسمزی و مکانیسمهای پاکسازی ROS 22
1-10 استفاده از تنظیم کننده‌های رشد برای کاهش اثرات تنش خشکی 32
1-11 پاکلوبوترازول 33
1-12 اهداف تحقیق 37
فصل دوم: مواد و روش‌ها
2-1 کشت گیاه Stevia rebaudiana Bertoni 40
2–2 اندازهگیری فاکتورهای رشد 42
2-3 استخراج و سنجش رنگیزههای فتوسنتزی 43
2-4 استخراج و سنجش رنگیزه آنتوسیانین 43
2-5 اندازه گیری پرولین 44
2-6 بررسی تغییرات کمی قندها 45
2-7 اندازه گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدها 46
2-8 اندازه گیری میزان پراکسید هیدروژن 47
2-9 اندازهگیری پروتئینهای محلول 47
2-10 اندازهگیری میزان آنتی اکسیدان کل 51
2-11 مطالعه فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان 51
2-12 تهیه عصاره گیاهی برای اندازه گیری متابولیت های آنتی اکسیدانی 55
2-13 آنزیمهای درگیر در مسیر متابولیسم پرولین 57
2-14 اندازه گیری میزان استویول گلیکوزیدها با استفاده از دستگاه HPLC 61
2-15 بررسی بیان ژنهای ent-KS، ent-KO، ent-KAH، UGT85C2، UGT76G1 و UGT74G1 با روش Real-Time PCR 62
2-16 طرح آماری مورد استفاده و آنالیز داده‌ها 64
فصل سوم: نتایج65
3-1 شاخصهای رشد گیاه استویا تحت تاثیر پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول 66
3-2 رنگیزه های فتوسنتزی گیاه استویا 71
3-3 رنگیزه آنتوسیانین برگهای گیاه استویا 74
3-4 محتوی پرولین آزاد برگهای گیاه استویا 75
3-5 کربوهیدراتهای برگ در تیمارهای پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول 76
3-6 پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء برگ 78
3-7 میزان پراکسید هیدروژن برگهای گیاه استویا 79
3-8 پروتئینهای محلول در برگهای گیاه استویا 80
3-9 الکتروفورز پروتئینهای برگ در تیمارهای پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول 81
3-10 اثر پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول بر میزان آنتیاکسیدان کل 83
3-11 فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان برگهای استویا 84
3-12 اثر پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول بر متابولیتهای آنتی اکسیدانتی 89
3-13 اثر پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول بر فعالیت پرولین 5-کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) و پرولین دهیدروژناز (PDH) 93
3-14 استویول گلیکوزیدهای برگ در تیمارهای پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول 99
3-15 اثر پلیاتیلن گلیکول و پاکلوبوترازول بر بیان ژنهای درگیر در مسیر بیوسنتز استویول گلیکوزیدها 114
فصل چهارم: بحث122
4-1 شاخصهای رشد گیاه استویا 123
4-2 رنگیزههای فتوسنتزی گیاه استویا 125
4-3 رنگیزه آنتوسیانین گیاه استویا 128
4-4 پرولین در گیاه استویا 129
4-5 کربوهیدراتهای گیاه استویا 131
4-6 پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء 133
4-7 پراکسید هیدروژن گیاه استویا 135
4-8 پروتئینهای محلول گیاه استویا 136
عنوان صفحه
4-9 نتایج الکتروفورز پروتئینهای برگهای گیاه استویا 138
4-10 میزان آنتیاکسیدان کل برگهای گیاه استویا 139
4-11 فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان برگهای گیاه استویا 140
4-12 فعالیت آنزیمهای درگیر در مسیر متابولیسم پرولین برگهای گیاه استویا 144
4-13 متابولیت های آنتی اکسیدانی گیاه استویا 145
4-14 استویول گلیکوزیدهای برگهای گیاه استویا 147
4-15 بیان ژن های بیوسنتز استویول گلیکوزیدها در گیاه استویا 148
جمعبندی نهایی 151
پیشنهادات 152
پیوستها 153
منابع 166
برای کسب اطلاعات بیشتر با ایمیل payaname@outlook.com در ارتباط باشید
